Luce 3D efficiente

Nov 23, 2023

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 170 (2023) Citare questo articolo

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La capacità di acquisire immagini di campioni di tessuto umano in 3D, sia con risoluzione cellulare che con un ampio campo visivo (FOV), può migliorare le indagini fondamentali e cliniche. Qui, dimostriamo la fattibilità dell'imaging a fogli luminosi di cervelli umani fissati in formalina di dimensioni ~ 5 cm3 e campioni di cancro alla prostata incorporati in paraffina fissati in formalina di dimensioni fino a ~ 7 cm3, elaborati con il protocollo FFPE-MASH. Presentiamo un prototipo di microscopia a foglio luminoso, il microscopio con illuminazione a piano selettivo a doppia vista (ct-dSPIM), in grado di acquisire rapidamente 3D ad alta risoluzione di tessuto depurato su scala cm3. Abbiamo utilizzato scansioni a mosaico per panoramiche 3D veloci di interi campioni di tessuto o panoramiche a risoluzione più elevata di ROI di grandi dimensioni con varie velocità: (a) Mosaic 16 (risoluzione isotropica di 16,4 µm, ~1,7 h/cm3), (b) Mosaic 4 (isotropica di 4,1 µm risoluzione, ~ 5 h/cm3) e (c) Mosaico 0,5 (0,5 µm vicino alla risoluzione isotropa, ~ 15,8 h/cm3). Potremmo visualizzare gli strati corticali e i neuroni attorno al confine delle aree V1 e V2 del cervello umano e potremmo dimostrare una qualità di imaging adeguata per la classificazione del punteggio Gleason in campioni spessi di cancro alla prostata. Mostriamo che l'imaging ct-dSPIM è una tecnica eccellente per valutare quantitativamente interi campioni di tessuto umano su larga scala preparati con MASH in 3D, con un notevole potenziale clinico futuro.

Nonostante gli evidenti vantaggi delle visualizzazioni microstrutturali su larga scala, i campioni di tessuto nella ricerca fondamentale e nella patologia clinica vengono ancora per lo più esaminati con microscopi ottici convenzionali in sezioni di tessuto sottilissime (che vanno da circa 5-100 µm), montate su vetrini. Ciò distrugge la struttura dell'organo 3D e fornisce solo informazioni 2D limitate su un piccolo campo visivo (FoV). Pertanto, sono necessari progressi significativi verso nuovi approcci di microscopia multiscala 3D ad alta velocità, ad alto volume e con una risoluzione sufficiente. Ciò consentirà il rilevamento di dettagli cruciali e caratteristiche generali in tutti i campioni di tessuto di grandi dimensioni (da mm a cm).

La complessa struttura 3D del cervello umano è intrinsecamente multiscala ed è costituita da strutture molto piccole che si estendono su grandi distanze, persino intere aree cerebrali1. La citoarchitettura corticale stratificata, ad esempio, è definita dalla densità cellulare, dalle dimensioni e dalla morfologia su scala microscopica, ma i suoi strati si estendono su intere aree corticali e quindi la stratificazione avviene su scale centimetriche. Per consentire la caratterizzazione quantitativa, come il conteggio delle cellule, in vari strati e persino in intere aree cerebrali, è necessario eseguire sia scansioni panoramiche del FoV di grandi dimensioni, sia immagini cellulari ad alta risoluzione. Questo tipo di dati è essenziale, ad esempio, per una modellazione neurale realistica e biologicamente informata2. Pertanto, lo studio della citoarchitettura stratificata richiede sia immagini ad alta risoluzione che FoV di grandi dimensioni.

Nel cancro della prostata, i tumori sono caratterizzati da multifocalità e da una morfologia eterogenea con diversi modelli istomorfologici in 3D, su volumi estesi3,4. Ad oggi, una diagnosi definitiva di cancro alla prostata richiede la verifica istopatologica delle biopsie basata sulla classificazione del Gleason Score3. Ciò rappresenta una sfida, come dimostrato dalla variabilità tra osservatori, che a sua volta può portare a un trattamento insufficiente o eccessivo dei pazienti4. Inoltre, i criteri per la “sorveglianza attiva” sono determinati dalla quantificazione dell’estensione del tumore e del grado di Gleason5. Poiché il sezionamento seriale completo dei campioni bioptici della prostata viene eseguito raramente, nei casi con piccoli focolai multipli di adenocarcinoma prostatico potrebbe verificarsi un sottograding, perché sono presenti a diversi livelli nei blocchi di paraffina5. Inoltre, possono verificarsi biopsie false negative a causa del sezionamento incompleto di blocchi di tessuto. Ad esempio, Paulk et al. dimostrare la presenza di carcinoma prostatico nelle sezioni più profonde dei blocchi di paraffina che era assente nelle sezioni H&E iniziali5. Nella pratica attuale, tagliare di routine interi blocchi di paraffina per aumentare la visualizzazione dei tessuti potrebbe non essere possibile a causa del carico di lavoro e del prezzo più elevati, rispetto alla procedura standard di sezionamento di soli 3-4 livelli.